Kategorie
Metody analityczne i czystość

Wynik oznaczenia czystości metodą HPLC opiera się na trzech cichych założeniach. Każde z nich potrafi zawieść — i zawsze w stronę zawyżenia.

Chromatografia cieczowa jest domyślną metodą oznaczania czystości i właśnie dlatego jej założenia bywają niewidoczne. Wynik „99,3% wg HPLC” wygląda na pomiar bezwzględny, a jest sumą kilku cichych założeń: że wszystko, co w próbce jest, wyszło z kolumny; że wyszło osobno; i że detektor zobaczył to w proporcji do ilości. Każde z tych założeń potrafi nie być spełnione i każde zawodzi w tę samą stronę — zawyżając wynik.

Ten tekst opisuje, gdzie dokładnie leżą granice metody, kiedy trzeba sięgnąć po technikę niezależną i jak czytać wynik chromatograficzny, żeby nie przypisać mu znaczenia, którego nie ma.

Detektor widzi chromofor, nie substancję

Najpowszechniejszy układ to detekcja w nadfiolecie. Sygnał powstaje wtedy, gdy cząsteczka pochłania promieniowanie przy wybranej długości fali — czyli gdy ma odpowiedni układ wiązań sprzężonych. Substancja bez chromoforu przy tej długości fali jest dla detektora przezroczysta: przejdzie przez kolumnę, wyjdzie z niej i nie zostawi śladu na chromatogramie.

Stąd pierwsza konsekwencja: normalizacja powierzchni, czyli liczenie udziału piku głównego w sumie wszystkich pików, milcząco zakłada, że wszystkie składniki próbki dają sygnał. Wystarczy jedna domieszka bez chromoforu, żeby wynik był zawyżony — i to bez żadnego widocznego objawu na chromatogramie.

Druga konsekwencja jest subtelniejsza: nawet gdy wszystkie składniki absorbują, robią to z różną intensywnością. Ten sam ułamek masy daje różną powierzchnię piku dla różnych substancji. Dlatego poważne oznaczenia zawartości wykonuje się wobec wzorca, a nie przez samą normalizację powierzchni — i dlatego w metodach oznaczania czystości rozwija się warianty z korektą wzorcem wewnętrznym.1

Istnieją też detektory odpowiadające na inne pytania. Detekcja polarymetryczna, opisana w literaturze chromatograficznej już pod koniec lat osiemdziesiątych, reaguje na czynność optyczną i pozwala dostrzec to, czego detektor absorpcyjny nie rozróżni.2 Wybór detektora jest więc wyborem tego, jakie zanieczyszczenia mają szansę zostać zauważone.

Współelucja: dwa związki, jeden pik

Jeżeli zanieczyszczenie opuszcza kolumnę w tym samym czasie co substancja główna, jego powierzchnia zostaje doliczona do piku głównego. Wynik czystości rośnie, a chromatogram wygląda wzorowo — jeden wysoki, symetryczny pik.

Właśnie dlatego opracowano osobne procedury badania jednorodności piku. Analiza głównych składowych danych z detektora z matrycą diodową pozwala sprawdzić, czy widmo rejestrowane na zboczu narastającym, w maksimum i na zboczu opadającym jest tym samym widmem.3 Jeżeli nie jest — pod jednym wierzchołkiem siedzą dwie substancje.

Ta weryfikacja nie jest formalnością. Metody chromatograficzne dla konkretnych substancji bywają latami udoskonalane właśnie po to, żeby rozdzielić to, co wcześniej wychodziło razem — dotyczy to zarówno metod farmakopealnych,4 jak i oznaczeń opracowywanych od zera dla trudnych układów.5 Rozwój metody jest w dużej mierze historią kolejnych rozdzieleń, których wcześniej nie widziano.

Co nie wychodzi z kolumny

Trzecie ciche założenie mówi, że wszystko, co weszło, wyszło. Nie zawsze tak jest. Substancje silnie zatrzymywane mogą opuszczać kolumnę długo po zakończeniu rejestracji — a jeśli czas analizy skrócono, po prostu nie pojawią się w wyniku. Inne wiążą się z wypełnieniem nieodwracalnie i nie wychodzą w ogóle.

Objawem bywa dryf linii podstawowej albo duchy pików w następnym wstrzyknięciu. Objawem bywa też cisza — i to jest przypadek najtrudniejszy, bo wygląda identycznie jak czysta próbka. Prace poświęcone oczyszczaniu związków o trudnym zachowaniu chromatograficznym pokazują, ile pracy trzeba włożyć w samo ustalenie, co z kolumny wychodzi, a co nie.6

Kiedy sama chromatografia nie wystarcza

Wniosek z powyższego nie brzmi, że metoda jest zawodna — brzmi, że metoda odpowiada na węższe pytanie, niż się jej zwykle przypisuje. Dlatego przy certyfikacji materiałów sięga się po techniki ortogonalne, oparte na innej zasadzie fizycznej.

Ilościowy rezonans magnetyczny mierzy liczbę jąder, a nie absorpcję, więc domieszka bez chromoforu nie jest dla niego niewidzialna. Zastosowanie widm protonowych do oznaczania czystości farmaceutycznych materiałów odniesienia jest opisane w literaturze metrologicznej.7

Bilans masowy podchodzi od strony domieszek: oznacza się wodę, rozpuszczalniki resztkowe i pozostałość po spopieleniu, a zawartość substancji wylicza z różnicy. Tak certyfikowano między innymi materiały odniesienia aminokwasów.8

Zestawienie dwóch niezależnych metod jest rozwiązaniem najmocniejszym. Przy certyfikacji materiału odniesienia kofeiny wynik spektrofotometryczny zweryfikowano ilościowym NMR — każda z metod ma inne ślepe pole, więc zgodność wyników niesie informację, której żadna z nich nie dałaby osobno.9

Jak czytać wynik chromatograficzny

Kilka pytań, które warto zadać, zanim przyjmie się liczbę.

  • Przy jakiej długości fali rejestrowano? To definiuje, co miało szansę być widoczne.
  • Jak długo trwała analiza? Krótki czas to ryzyko, że coś jeszcze nie wyszło z kolumny.
  • Czy wynik pochodzi z normalizacji powierzchni, czy z porównania ze wzorcem? To dwie różne wielkości.
  • Czy sprawdzono jednorodność piku głównego? Bez tego wynik zawiera założenie o kompletnym rozdziale.
  • Czy jakakolwiek metoda niezależna potwierdziła rząd wielkości? Jedna technika to jedno ślepe pole.

Warto też pamiętać, że oznaczenia chromatograficzne w złożonych matrycach mają własne, dobrze udokumentowane pułapki — niezależnie od tego, czy chodzi o ocenę jakości surowca roślinnego,10 o oznaczanie związków silnie polarnych11 czy o analizę grup związków wymagających specjalnie dobranych warunków.12 Metody oznaczania czystości dla konkretnych klas substancji opracowuje się i publikuje osobno właśnie dlatego, że uniwersalnych warunków nie ma.13

Co z tego wynika dla kogoś, kto kupuje odczynnik? Tyle, że wynik HPLC jest dobrym punktem wyjścia i słabym punktem dojścia. Mówi, że w zarejestrowanym oknie czasowym, przy wybranej długości fali, pik główny stanowił określony udział sygnału. To użyteczna informacja — pod warunkiem, że nie czyta się jej jako „w pojemniku jest 99,3% tej substancji”. Skąd biorą się różnice między metodami, opisujemy w tekście o tym, co realnie oznacza liczba na certyfikacie, a sam dokument rozkładamy na części w tekście o certyfikacie analizy.

Źródła

Każda pozycja poniżej została pobrana z bazy PubMed przez interfejs E-utilities i nie jest odtwarzana z pamięci. Numery PMID prowadzą do rekordów źródłowych.

  1. Sun X, Zhang W, Huang T i in.. Purity determination of pyributicarb by internal standard correction-high-performance liquid chromatography-quantitative nuclear magnetic resonance. Anal Bioanal Chem. 2020;412:6983-6993. PMID: 32754793. DOI: 10.1007/s00216-020-02832-0.
  2. Lloyd DK, Goodall DM. Polarimetric detection in high-performance liquid chromatography. Chirality. 1989;1:251-64. PMID: 2701852. DOI: 10.1002/chir.530010403.
  3. Wiberg K, Andersson M, Hagman A i in.. Peak purity determination with principal component analysis of high-performance liquid chromatography-diode array detection data. J Chromatogr A. 2004;1029:13-20. PMID: 15032344. DOI: 10.1016/j.chroma.2003.12.052.
  4. Salkić A, Otašević B, Zečević M. Improvement of Pharmacopeial High-Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Enantiomeric Purity of Moxifloxacin Drug Substance. J Sep Sci. 2025;48:e70190. PMID: 40485329. DOI: 10.1002/jssc.70190.
  5. Samoilov M, Zubareva E, Degterev M. Development and Validation of an Ion-Pair Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry Method for Determination of Purity of Nusinersen for Quality Control of Drug Substance or Drug Product. Int J Mol Sci. 2026;27. PMID: 41977479. DOI: 10.3390/ijms27073301.
  6. Lawton LA, Edwards C. Purification of microcystins. J Chromatogr A. 2001;912:191-209. PMID: 11330790. DOI: 10.1016/s0021-9673(01)00592-1.
  7. Monakhova YB, Kohl-Himmelseher M, Kuballa T i in.. Determination of the purity of pharmaceutical reference materials by 1H NMR using the standardless PULCON methodology. J Pharm Biomed Anal. 2014;100:381-386. PMID: 25215441. DOI: 10.1016/j.jpba.2014.08.024.
  8. Liu H, Cheow PS, Yong S i in.. Determination of purity values of amino acid reference materials by mass balance method: an approach to the quantification of related structure impurities. Anal Bioanal Chem. 2020;412:8023-8037. PMID: 32914399. DOI: 10.1007/s00216-020-02936-7.
  9. Shehata AB, Rizk MS, Rend EA. Certification of caffeine reference material purity by ultraviolet/visible spectrophotometry and high-performance liquid chromatography with diode-array detection as two independent analytical methods. J Food Drug Anal. 2016;24:703-715. PMID: 28911607. DOI: 10.1016/j.jfda.2016.06.009.
  10. Valle García-Rodríguez M, Serrano-Díaz J, Tarantilis PA i in.. Determination of saffron quality by high-performance liquid chromatography. J Agric Food Chem. 2014;62:8068-74. PMID: 25075549. DOI: 10.1021/jf5019356.
  11. Liu Y, Xing JL, Shen J i in.. [Simultaneous determination of six rare sugars in solid foods by high performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detection]. Se Pu. 2023;41:781-788. PMID: 37712542. DOI: 10.3724/SP.J.1123.2023.02014.
  12. Rubert-Nason KF, Hedman CJ, Holeski LM i in.. Determination of salicinoids by micro-high-performance liquid chromatography and photodiode array detection. Phytochem Anal. 2014;25:185-91. PMID: 24847528. DOI: 10.1002/pca.2485.
  13. Sobolewska E, Biesaga M. High-Performance Liquid Chromatography Methods for Determining the Purity of Drugs with Weak UV Chromophores – A Review. Crit Rev Anal Chem. 2025;55:419-433. PMID: 38180794. DOI: 10.1080/10408347.2023.2291815.

Czytaj też